Курсовая работа: Методы клинической вирусологии
2.2 Иммуноэлектронная микроскопия
Описанный ниже метод иммуноэлектронной микроскопии представляет собой только один из множества подобных иммунологических методов. Для исследования вирусоспецифических антител, кроме того, используют метод, предполагающий связывание с микроскопической сеткой белка А. Рабочую концентрацию антивирусных антител определяют методом проб и ошибок в диапазоне от 1/10 до 1/1000. Указанная нами концентрация, как правило, используется в рутинной работе. Для получения оптимальных результатов взаимодействия антител с вирусом таким же образом титруют сыворотку, содержащую парвовирус.
1. 10 мкл антисыворотки к парвовирусу человека в 100 раз разводят PBS. Раствор нагревают в водяной бане до 56°С.
2. Обычным способом расплавляют 10 мл 2%-ной агарозы в PBS и охлаждают до 56 °С в водяной бане.
3. При 56 °С смешивают 1 мл разведенной антисыворотки с 1 мл 2%-ной агарозы.
4. Переносят по 200 мкл полученной смеси в две лунки 96-луночного планшета для микротитрования.
5. Агарозе дают застыть при комнатной температуре. Планшет можно хранить при 4°С в течение нескольких недель, если заклеить его клейкой лентой.
6. В лунку, содержащую смесь агарозы с антисывороткой, вносят 10 мкл сыворотки, содержащей парвовирус.
7. Сетку для электронной микроскопии с заранее приготовленным углеродно-формваровым покрытием кладут менее блестящей стороной на каплю сыворотки.
8. Сетку выдерживают 2 ч при 37 °С во влажной камере.
9. Тонким пинцетом достают сетку и наносят каплю 2%-ной фосфорно-вольфрамовой кислоты на ту поверхность сетки, которая находилась в контакте с сывороткой.
10. Через 30 с отмывают избыток краски, высушивают препарат и инактивируют вирус.
Агрегированные вирусные частицы исследуют под трансмиссионным электронным микроскопом при увеличении от 30000 до 50000.
3. Идентификация вирусных антигенов
Вирусы, находящиеся в тканях или тканевых жидкостях, можно идентифицировать по вирусоспецифическим белкам с помощью реакции антиген — антитело. Продукт реакции антиген — антитело тестируют по метке, которую вводят либо непосредственно в антивирусные антитела, либо в антитела, направленные против вирусоспецифических антител. Антитела можно пометить флуоресцеином, радиоактивным иодом или ферментом, расщепляющим субстрат с изменением окраски. Кроме того, для идентификации вируса используют реакцию гемагглютинации. В повседневной практике описанные методы применяют главным образом для обнаружения в крови антигенов вируса гепатита В и поиска антигенов разных вирусов, вызывающих различные респираторные заболевания.
В настоящее время многими фирмами выпускаются эритроцитарные, радиоактивные и ферментативные диагностикумы, в том числе для обнаружения вируса гепатита В. Мы не считаем целесообразным излагать методы работы с указанными диагностикумами: вполне достаточно следовать прилагаемым инструкциям. Ниже мы остановимся на иммунофлуоресцентном методе идентификации респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях.
3.1 Идентификация респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях методом иммунофлуоресценции
Метод получения препаратов носоглоточных выделений описан Гарднером и Мак-Квилином. В лабораторных условиях эта операция выполняется в два этапа. Сначала готовят мазок из носоглоточной слизи на предметном стекле. Полученные мазки можно хранить в фиксированном состоянии при —20 °С в течение многих месяцев. На втором этапе окрашивают мазки для выявления антигена респираторно-синцитиального вируса. Для этой цели используют метод непрямой иммунофлуоресценции.
3.1.1 Приготовление препаратов носоглоточных выделений
1. Слизь со специальных щипцов смывают 1—2 мл PBS и переносят в центрифужную пробирку.
2. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.
3. Надосадочную жидкость сливают.
4. Осадок клеток осторожно ресуспендируют в 2—3 мл PBS до получения гомогенной суспензии. Для этого используют ши-рокогорлую пастеровскую пипетку.
5. Полученную суспензию переносят в пробирку.
6. К суспензии добавляют еще 2—4 мл PBS и перемешивают пипетированием. Крупные сгустки слизи удаляют.
7. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.
8. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в таком объеме PBS, чтобы полученная суспензия легко отделялась от стенок пробирки.
9. Полученную суспензию наносят на размеченное предметное стекло.
10. Стекло подсушивают на воздухе.