Курсовая работа: Методы клинической вирусологии
При невысоком титре интерпретировать результаты сложно, так как при небольшом разведении возможно остаточное присутствие неспецифических ингибиторов. Наличие вирусоспецифических антител считается доказанным при титре 16 или выше.
5.2 Реакция связывания комплемента
Принцип реакции связывания комплемента основан на том, что взаимодействие антител с вирусными антигенами приводит к активации, а следовательно, к связыванию комплемента. Остающийся комплемент можно обнаружить, используя эритроциты барана, сенсибилизированные антиэритроцитарными антителами. Эти антитела обычно называют гемолизинами и получают из сыворотки кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Несвязавшийся комплемент вызывает лизис эритроцитов. В случае связывания комплемента в первой реакции лизиса эритроцитов барана не происходит.
Таким образом, количество специфических антител в сыворотке можно определить при тестировании ее последовательных разведений с известным микробиологическим антигеном в присутствии комплемента и с последующим добавлением сенсибилизированных эритроцитов барана.
Для получения достоверных воспроизводимых результатов необходимо строго соблюдать пропорции используемых реагентов. Поэтому перед постановкой реакции необходимо определить соответствующие концентрации комплемента, гемолитической сыворотки и антигена. Ниже мы приводим пример определения специфических антител к вирусу краснухи в РСК-
5.2.1 Титрование комплемента и гемолитической сыворотки
Здесь так же, как и в РТГА, используют полистироловые 96-луночные планшеты с U-образным дном и микротитратор
Постановка реакции
1. Растворяют в требуемом по инструкции объеме дистиллированной воды лиофилизированный препарат комплемента.
2. Нумеруют восемь стеклянных пробирок.
3. Готовят 60-кратное разведение комплемента в первой пробирке. Для этого 0,1 мл комплемента разводят 0,7 мл дистиллированной воды и 4,0 мл вероналового буферного раствора. Лиофилизированный комплемент содержит криопротектор, поэтому добавление 0,7 мл дистиллированной воды к 0,1 мл растворенного комплемента дает 10-кратное разведение.
4. В оставшиеся семь пробирок вносят по 0,4 мл VBS.
5. 1,6 мл содержимого первой пробирки переносят во вторую, перемешивают, затем из второй переносят 1,6 мл в третью и т.д. до восьмой пробирки. Перед каждым переносом пипетку промывают в VBS. Таким образом получают последовательные разведения комплемента с 20%-ной разницей между ними, т.е. 1:60, 1:75, 1:94, 1:118, 1:148, 1:184, 1:230, 1:288.
6. Размечают 96-луночный планшет, как указано на рис. 5.
7. В лунки 1—8 рядов 1—7 вносят по два объема VBS.
8. В лунки 9 рядов 1—6 вносят по три объема VBS.
9. В лунки 1—8 рядов 1—7 добавляют по одному объему приготовленных разведений комплемента.
10. Планшет закрывают и оставляют на ночь при 4°С.
На следующее утро готовят последовательные двукратные разведения гемолитической сыворотки от 1:25 до 1: 800; в особую пробирку вносят 1 мл VBS. В пробирку 1 вносят 2,4 мл VBS и 0,1 мл гемолитической сыворотки. По 1 мл VBS добавляют в пробирки 2—6. Из первой пробирки переносят 1 мл во вторую пробирку и т.д. до шестой пробирки, промывая пипетку после каждого переноса. Удаляют 0,5 мл из первой пробирки и 1 мл из шестой пробирки для того, чтобы объем жидкости в каждой пробирке составил 1 мл.
12. Эритроциты барана трижды промывают в VBS.
13. Затем супернатант сливают и эритроциты суспендируют б оставшемся объеме жидкости.
14. Определяют объем полученной суспензии эритроцитов и разводят ее VBS до получения 4%-ной суспензии.
15. По 1 мл суспензии эритроцитов добавляют в семь соответственно помеченных пробирок, следуемых за рядом пробирок с разведенной гемолитической сывороткой, а также в контрольную пробирку.
16. Суспензии эритроцитов смешивают с соответствующими разведениями гемолизина, закрывают пробирки и инкубируют 20 мин на водяной бане при 37 °С.
17. В то же время в термостате или термальной комнате разогревают приготовленный накануне планшет для микротитрования.
18. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и по одному объему каждого разведения вносят в соответствующий ряд лунок.
19. Ресуспендируют содержимое лунок, постукивая по планшету, и оставляют его на 30 мин при 37 °С. Через 15 мин инкубирования необходимо повторно суспендировать клетки встряхиванием планшета.
20. Для получения окончательного результата планшет выдерживают примерно 90 мин при 4°С.