Курсовая работа: Методы клинической вирусологии
12. После фиксации стекло опять подсушивают на воздухе.
13. Полученные препараты окрашивают немедленно либо хранят при —20 °С.
3.1.2. Методика окрашивания
1. Распечатывают и разводят в PBS коммерческую антисыворотку против РСВ до рекомендованной рабочей концентрации.
2. Пастеровской пипеткой наносят одну каплю антисыворотки на приготовленный препарат.
3. Препарат помещают во влажную камеру.
4. Препарат инкубируют 30 мин при 37 °С.
5. Образцы осторожно отмывают PBS от избытка антител в специальном резервуаре.
6. Отмывку образцов проводят в трех сменах PBS по 10 мин в каждой.
7. Образцы высушивают, удаляют избыток PBS фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.
8. Распечатывают и разводят конъюгированные с флуоресцеином антитела до нужной концентрации.
9. На препарат наносят каплю разведенных флуоресцирующих антител.
10. Препарат инкубируют 30 мин при 37 °С.
Препарат трижды промывают PBS.
12. Промывают 2 мин в дистиллированной воде.
13. Осторожно удаляют избыток дистиллированной воды и высушивают на воздухе.
14. Используя иммерсионное масло, препараты исследуют под флуоресцентным микроскопом. Покровное стекло и заключение препарата не требуются.
3.1.3 Интерпретация результатов
О присутствии антигенов РСВ свидетельствует флуоресценция цитоплазмы отдельных клеток. Необходимо сравнивать исследуемые препараты с контрольными, как заведомо положительными, так и заведомо отрицательными.
4. Культуры клеток
С появлением метода культуры тканей, позволяющего выращивать вирус в монослое клеток на стекле или пластике, клиническая вирусология достигла значительных успехов. Открытие антибиотиков, подавляющих рост бактерий и грибов, позволило ввести метод культуры ткани в повседневную практику.
В одной диагностической лаборатории нецелесообразно культивировать сразу большое количество клеточных линий, необходимых для выделения всех известных вирусов человека.
Количество клеточных линий, ведущихся в одной лаборатории, зависит от ряда факторов, прежде всего от степени доступности эмбриональной ткани, от интереса к определенным вирусам и т.д. Как правило, в оптимальное число необходимых клеточных линий должны входить: эпителиальные клеточные линии, используемые в качестве первичных или вторичных культур; перевиваемые или полуперевиваемые линии фибробластов легкого эмбриона человека или клеток линии MRC 5); перевиваемые линии эпителиальных клеток, как, например, НЕр-2 или HeLa.
Клиническую диагностику вирусов, как правило, проводят в два этапа: на первом — убеждаются в вирусной природе заболевания, на втором — идентифицируют вирус. Чаще всего вирус обнаруживают по ЦПД. При некоторых заболеваниях для постановки предварительного диагноза достаточно располагать сведениями о ЦПД и клинической картине заболевания. Так, например, во многих лабораториях, где проводят заражение фибробластов материалом, полученным с генитального мазка, указывают, что «обнаружены признаки ЦПД, характерные для вируса простого герпеса». При этом последующую формальную идентификацию вируса не проводят. В других случаях признаки ЦПД характеризуют большую группу вирусов, например энте-ровирусов 67 типов. Здесь постановка более точного диагноза будет зависеть от результатов реакции нейтрализации вируса специфическими антисыворотками. Последняя процедура требует много времени, поэтому возможны промежуточные сообщения, например «выделены энтеровирусы, необходима дальнейшая идентификация».
Некоторые вирусы, например миксо- и парамиксовирусы, обычно не вызывают заметного ЦПД, однако изменяют поверхность культивируемых клеток таким образом, что последние начинают связывать эритроциты. Клинический материал инкубируют с клетками монослойной культуры, на которую затем наносят суспензию эритроцитов. После инкубации с эритроцитами культуры тщательно промывают и учитывают результаты. Дальнейшую идентификацию проводят с помощью реакции торможения гемадсорбции специфическими антисыворотками. Некоторые из указанных выше вирусов продуцируют растворимый гемагглютинин, поэтому их идентифицируют методом торможения гемагглютинации.
Другие вирусы идентифицируют методом непрямой иммуно-флуоресценции. Подобным образом определяют и РСВ. Однако в тех случаях, когда клинические симптомы и характер ЦПД не позволяют отнести вирус к той или иной группе, необходимо исследовать клеточный гомогенат под электронным микроскопом. Подобным образом время от времени следует исследовать и клеточные культуры, используемые в рутинной работе, для исключения случайной вирусной инфекции.
В табл. 2 представлены основные группы болезнетворных вирусов, клеточные линии для их выделения, а также способы выявления и идентификации.
Таблица 2. Чувствительные клеточные линии, способы выявления и идентификации наиболее распространенных вирусов, вызывающих заболевания человека
| Вирусы | Чувствительная клеточная линия | Выявление и идентификация |
|
Аденовирусы Вирус Коксаки А Вирус Коксаки В Цитомегаловирус Эховирусы К-во Просмотров: 541
Бесплатно скачать Курсовая работа: Методы клинической вирусологии
|