Курсовая работа: Методы клинической вирусологии
1:20. Его и следует использовать при тестировании неизвестной сыворотки.
В рассматриваемом случае титр положительной сыворотки равен 160, т. е. обратной величине разведения, позволяющего различить два произвольных разведения СК-антигена вируса краснухи.
5.2.3 Тестирование неизвестной сыворотки
Титрование сыворотки. 1. В стеклянных пробирках готовят четырехкратные разведения исследуемой, контрольной положительной и контрольной отрицательной сывороток, смешивая 0,1 мл каждой сыворотки с 0,3 мл VBS.
2. Для инактивации присутствующего в сыворотке комплемента пробирки инкубируют на водяной бане 30 мин при 56 °С.
3. 96-луночный планшет для микротитрования размечают, как указано на рис. 7.
4. В лунки 1—8 и 10 вносят по одному объему VBS. Количество заполненных рядов должно соответствовать числу тестируемых сывороток.
5. В лунки 1 и 10 добавляют по одному объему разведенной в четыре раза сыворотки.
6. С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в первых восьми лунках. Таким образом получают последовательные двукратные разведения от 1:8 до 1: 1024. Из лунок 8 микротитратором удаляют по 0,025 мл.
7. В лунку с контролем антигена добавляют один объем VBS, а в лунку с контролем клеток — три объема VBS.
8. По одному объему КС-антигена вируса краснухи добав* ляют в каждую лунку, за исключением тех, где содержатся контроли сывороток, клеток и комплемента.
9. Один объем разведения, содержащего ЗЕК50, добавляют во все лунки, кроме лунок с контролем комплемента и контролем клеток.
10. Контроль комплемента готовят, как описано выше.
Планшет закрывают и оставляют на ночь при 4°С.
12. Планшет выдерживают 30 мин при 37 °С, а затем в каждую лунку добавляют сенсибилизированные эритроциты, как описано выше.
13. Планшет инкубируют при 37 °С, как описано выше. Перед учетом результатов планшет выдерживают 90 мин при 4° для осаждения клеток.
Учет полученных результатов. На рис. 7 показан результат тестирования четырех неизвестных сывороток. Контроль комплемента подтверждает, что разведение комплемента действительно содержит ЗЕКбо Контроль клеток свидетельствует об отсутствии спонтанного лизиса сенсибилизированных эритроцитов. Полный лизис в лунках, содержащих контроли антигена и сывороток, свидетельствует о том, что для связывания комплемента необходимо образование комплекса антиген — антитело. Поэтому, если сыворотки содержат иммунные комплексы и инфицированы бактериями, результат реакции может быть искажен. Контроль с заведомо отрицательной сывороткой свидетельствует об отсутствии иммунных антител. Контроль заведомо положительной сыворотки показывает, что она содержит антитела в разведении 1: 128. В 256-кратном разведении антитела обнаружить не удалось. Таким образом, титр контрольной положительной сыворотки равен 128. Титры тестируемых сывороток от А до D составляют соответственно 8, 256, 16 и 64.
5.3 Радиальный гемолиз
Радиальный гемолиз — прекрасный метод для обнаружения IgG к вирусу краснухи, поскольку этим чувствительным и специфичным методом можно одновременно тестировать большое число сывороток.
IgG, специфичные к вирусу краснухи, обнаруживают по лизису эритроцитов, связанных с антигеном вируса краснухи и суспендированных в агарозном геле в присутствии комплемента.
Содержащиеся в сыворотке IgG к антигену вируса краснухи, связанному с эритроцитами, выявляют при одновременном тестировании контрольных гелей, содержащих комплемент и эритроциты, свободные от антигенов краснухи.
5.3.1 Приготовление гелей для радиального гемолиза
1. Расплавляют обычным образом два объема 1%-ной агарозы на буфере для постановки РСК и охлаждают до 43°С в водяной бане.
2. Эритроциты барана трижды промывают центрифугированием и ресуспендированием в том же буфере.
3. Трижды промытые клетки опять ресуспендируют в том же буфере, получая 15%-ную суспензию. В две пробирки, обозначенные «опыт» и «контроль», вносят по 0,3 мл полученной суспензии.
4. Растворяют ГА-антиген вируса краснухи и смешивают с 0,3 мл суспензии эритроцитов в пробирке, обозначенной «опыт».
5. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
6. Обе пробирки заполняют буфером для постановки РСК и центрифугируют для осаждения эритроцитов.