Курсовая работа: Методы клинической вирусологии

Оптимальной сенсибилизирующей концентрацией гемолитической сыворотки считают ее разведение, обеспечивающее наибольший лизис при максимальном разведении комплемента. На рис. 5 ОСК составляет 1: 100. В описанных ниже опытах гемолитическую сыворотку используют именно в этом разведении.

Разведение комплемента, обеспечивающее 50%-ный лизис при ОСК гемолитической сыворотки содержит одну единицу комплемента - На рис. 5 EKsoсодержится в разведении 1:184, поэтому для тестирования следует использовать комплемент в разведении 1: 60.

5.2.2 Титрование связывающего комплемент антигена вируса краснухи с положительной контрольной сывороткой

Постановка титрования. 1. Разводят лиофилизированный СК-ан-тиген вируса краснухи дистиллированной водой до указанной в инструкции концентрации.

2. Нумеруют шесть пробирок.

3. В пробирку 1 вносят 0,2 мл антигена вируса краснухи и 0,8 мл VBS.

4. В пробирки 2—6 добавляют по 0,5 мл VBS.

5. Из первой пробирки во вторую переносят 0,5 мл и т.д. до шестой пробирки, получая таким образом последовательные разведения антигена 1:5, 1: 10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 160.

6. Разводят лиофилизированный препарат заведомо положительной антисыворотки дистиллированной водой.

7. К 0,1 мл сыворотки добавляют 3,9 мл VBS.

8. Готовят последовательные двукратные разведения антисыворотки на VBS.

9. Размечают полистироловый 96-луночный планшет, как показано на рис. 6.

10. В каждую лунку, содержащую контрольную антисыворотку, и в каждую лунку, содержащую контрольный антиген, вносят по одному объему VBS.

В лунки 1—6 рядов 1—5 добавляют по одному объему соответствующего разведения сыворотки.

12. В лунки 1—6 рядов 1—5 добавляют по одному объему соответствующего разведения антигена.

13. В каждую лунку вносят по одному объему разведения, содержащего ЗЕКбо-

14. Для проверки правильности выбора концентрации комплемента в четыре контрольные лунки вносят 6, 3, 1,5 и 0,75 ЕК.50 соответственно. Далее проводят следующие операции:

а) в лунки рядов 1, 3, 4 добавляют по одному объему VBS; в лунки ряда 2 — два объема VBS;

б) в лунки ряда 1 добавляют два объема комплемента, а в лунки рядов 2 и 3 — по одному объему комплемента;

в) с помощью микротитратора переносят 0,025 мл из лунок ряда 3 в лунку ряда 4;

г) из лунок ряда 4 микротитратором удаляют 0,025 мл;

д) в лунки рядов 3 и 4 вносят по два объема VBS. 14. Планшет оставляют на ночь при 4°С.

16. Утром планшет выдерживают 30 мин при 37°С.

17. Готовят 4%-ную суспензию эритроцитов барана; 2,5 мл этой суспензии смешивают с равным объемом гемолизина, разведенного в VBS до ОСК. Гемолизин добавляют при постоянном перемешивании, переворачивая пробирки 10—12 раз. Сенсибилизированные эритроциты инкубируют в водяной бане 30 мин при 37 °С.

18. В каждую использованную лунку планшета добавляют по одному объему сенсибилизированных эритроцитов.

19. Для перемешивания планшет покачивают, затем накрывают крышкой и инкубируют 15 мин при 37°С. Затем содержимое лунок еще раз перемешивают, покачивая планшет, и продолжают инкубацию еще 15 мин.

20. Для получения окончательного результата планшет выдерживают около 90 мин при 4 °С.

Интерпретация полученных результатов. На рис. 6 показан типичный результат тестирования. Контроль комплемента свидетельствует о правильности выбора концентрации комплемента. Контроль антигена и антисыворотки свидетельствует о том, что для связывания комплемента необходимо образование комплекса антигел — антитело.

Оптимальным разведением СК-антигена вируса краснухи считают разведение, обеспечивающее максимальное связывание комплемента при наибольшем разведении сыворотки. В нашем примере таким разведением является разведение