Курсовая работа: Специфичность фермента амилазы
В основе жизненного процесса лежит обмен веществ, составными звеньями которого являются многочисленные биохимические реакции, катализируемые ферментами. Отравление (ингибирование) какого-либо одного фермента может оказать глубокое, а иногда и фатальное влияние на весь организм. Учение об ингибиторах ферментов имеет большое фундаментальное значение для фармакологии и токсикологии. Оно находит и непосредственное практическое применение, в том числе и в военном деле. Так, нервно-паралитические газы представляют собой специфические ингибиторы ферментов. В качестве инсектицидов все шире используются соединения, родственные ингибиторам ферментов. В практической медицине ингибиторы амилаз успешно применяются в качестве препаратов для лечения заболеваний, связанных с повышенной активностью этих ферментов - диабета, кариеса, ожирения и др.
В чисто академическом плане специфические ингибиторы используются как эффективные инструменты для изучения механизма действия ферментов, строения их активного центра.
Природные ингибиторы отличаются некоторыми особенностями: они действуют в чрезвычайно низких концентрациях (от 10-6 до 10-12 М), обычно являются необратимыми и т.д. Эти ингибиторы часто в природе выполняют роль регуляторов межвидовых отношений. Так, известно, что ингибиторы амилаз из проросших зерен злаковых токсичны для насекомых и млекопитающих. Недавно ингибиторы амилаз обнаружены среди так называемых "патоген - обусловленных" белков (PR-белков), участвующих в механизме защиты растений от патогенов.
Ингибиторы подразделяются на обратимые и необратимые. Необратимые ингибиторы связывают или разрушают функциональные группы молекулы фермента, необходимые для проявления его каталитической активности, при этом активность фермента не восстанавливается даже в том случае, если ингибитор удаляется каким либо способом. Необратимыми ингибиторами являются цианиды, действующие на ряд окислительно-восстановительных ферментов, содержащих в качестве кофакторов металлы. Ингибиторы типа цианидов способны образовывать устойчивые комплексы с металлами и поэтому инактивируют ферменты.
Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.
Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным) центром. Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой. Этот фермент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фумаровую:
Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структурного сходства его с истинным субстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет взаимодействовать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом полностью исключается перенос атома водорода от малоната. Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат) все же несколько различаются. Поэтому они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс. Этот тип ингибирования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма.
В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:
Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом ЕI, в отличие от фермент-субстратного комплекса ES не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации комплекса EI, или ингибиторную константу Кi , можно, следуя теории Михаэлиса–Ментен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:
т.е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению концентрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концентрации комплекса EI.
Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью ферментов бактерий.
Рис. 1 Действие конкурентного ингибитора (схема по В.Л. Кретовичу). Е - фермент; S - субстрат; Р1 и Р2 - продукты реакции; I - ингибитор.
Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.
Некоторые аналоги витамина В6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин, действуют как конкурентные, так называемые коферментные, ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие интенсивно протекающие при патологии биологические процессы в организме. Применение подобных аналогов в медицинской практике (в частности, в дерматологии и онкологии) основано на конкурентном вытеснении коферментов из субстрат связывающих центров ключевых ферментов обмена.
Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекуле фермента.
Следует указать, что неконкурентное ингибирование также может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее. При обратимом неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются с разными центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI, так и тройного комплекса EIS; последний может распадаться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.
Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом, так и с ES-комплексом.
Известно, кроме того, так называемое бесконкурентное ингибирование, когда ингибитор связывается с ферментом также в некаталитическом центре, однако не со свободным ферментом, а только с ES-комплексом в виде тройного комплекса.
Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнениями Михаэлиса-Ментен, Лайнуивера-Бэрка или другими, например уравнением Эди-Хофсти:
ν = -Km (y/[S]) + Vmax
и соответствующими графиками в прямолинейных координатах.
