Статья: Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот
Номер Компоненты среды, об% Величина Выход Время
опыта лаг-фазы биомассы генер.
Н2 О 2 Н2 О СН3 ОН С2 Н3 О2 Н часы % ч
8
99,9
0
13 СН3 ОН
1,0
0
20,8
72,0
1,0
Как и следует из литературных данных, введение стабильного изотопа 13 С не приводит к летальным последствиям для клетки, что мы и наблюдали в случае с M. flagellatum . В целом, полученные для M. flagellatum данные могут свидетельствовать о том, что адаптация к 2 Н2 О определяется как видовой специфичностью метилотрофных бактерий, так и особенностями их метаболизма.
Изучение ростовых и биосинтетических характеристик B. methylicum на средах, содержащих СН3 ОН/С2 Н3 О2 Н и 2 Н2 О .
Данные по росту исходного и адаптированного к 2 Н2 О штамма B. methylicum и максимальному уровню накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах, содержащих 2 об.% СН3 ОН (С2 Н3 О2 Н) иступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды представлены в таблице 2. Как видно из этих данных, в отсутствие дейтерий-меченных субстратов продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. таблицу 2, опыт 1). С увеличением концентрации 2 Н2 О в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% 2 Н2 О и 2 об.% С2 Н3 О2 Н (таблица 2, опыт 10). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением степени изотопного насыщения среды дейтерием постепенно увеличивается, достигая 4,9 часов на максимально дейтерированной среде. Как видно из табл. 2, опыт 2, С2 Н3 О2 Н не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал влияния на выходе микробной биомассы, в то время как на средах с 98 об.% 2 Н2 О микробный рост подавлялся. Так, на среде, содержащей 98 об.% 2 Н2 О и 2 об.% С2 Н3 О2 Н, выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза по-сравнению с контролем. Важно, что выход микробной биомассы, время клеточной генерации и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к 2 H2 O штамма B. methylicum на среде, содержащей 98 об.% 2 Н2 О и 2 об.% С2 Н3 О2 Низменяются незначительно (табл. 2, опыт 10’).
Таблица 2.
Влияние изотопного состава среды на рост штамма B. methylicum и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости.
|
Номер Компоненты среды, об% Величина Выход Время ген. Уровень опыта лаг-фазы биомассы часы секреции Н2 О 2 Н2 О СН3 ОН С2 Н3 О2 Н часы % L-Phe, % | ||||||||
| 1 | 98 | 0 | 2 | 0 | 24,0 | 100 | 2,2 | 100 |
| 2 | 98 | 0 | 0 | 2 | 30,3 | 92,3 | 2,4 | 99,1 |
| 3 | 73,5 | 24,5 | 2 | 0 | 32,1 | 90,6 | 2,4 | 96,3 |
| 4 | 73,5 | 24,5 | 0 | 2 | 34,7 | 85,9 | 2,6 | 97,1 |
| 5 | 49,0 | 49,0 | 2 | 0 | 40,5 | 70,1 | 3,0 | 98,0 |
| 6 | 49,0 | 49,0 | 0 | 2 | 44,2 | 60,5 | 3,2 | 98,8 |
| 7 | 24,5 | 73,5 | 2 | 0 | 45,8 | 56,4 | 3,5 | 90,4 |
| 8 | 24,5 | 73,5 | 0 | 2 | 49,0 | 47,2 | 3,8 | 87,6 |
| 9 | 0 | 98,0 | 2 | 0 | 60,5 | 32,9 | 4,4 | 79,5 |
| 10 | 0 | 98,0 | 0 | 2 | 64,4 | 30,1 | 4,9 | 71,5 |
| 10’ | 0 | 98,0 | 0 | 2 | 39,9 | 87,0 | 2,9 | 95,0 |
*Данные (1-10) приведены для B. methylicum , не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.
Данные 10’ приведены для адаптированого B. methylicum .
За счёт использования данного штамма B. methylicum удалось получить десятки миллиграмм высокомеченного дейтерием фенилаланина из 20 г клеточной биомассы.
Изучение уровней включения изотопов 2 Н- и 13 С в секретируемые аминокислоты метилотрофных бактерий .
Эффективность использования дансильных и Z-производных аминокислот для масс-спектрометрических исследований была показана раннее [10, 16]. В данной работе уровни включения изотопов 2 Н-и 13 С в мультикомпонентные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ.
Производные аминокислот получали прямой обработкой препаратов культуральной жидкости и гидролизатов суммарных белков биомассы карбобензоксихлоридом (ZCl) или дансилхлоридом (DnsCl) и диазометаном (CH2 N2 ). Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении карбобензоксихлорид (дансилхлорид)-аминокислота, равным 2:1 (схема 1).
Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с монопроизводными было характерно образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Z,(Dns)-лизина, ди-Z,(Dns)-гистидина, О,N-ди-Z,(Dns)-тирозина, O,N-ди-Z,(Dns)-серина, O,N-ди-Z,(Dns)-треонина и N,S-ди-Z,(Dns)-цистеина (на схеме 1 эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-Z,(Dns)-аргинин.
Летучесть дансилпроизводных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана как этерифицирующего реагента был обусловлен необходимостью проведения реакции в мягких условиях, исключающих изотопный (1 Н-2 Н) обмен в ароматических аминокислотах.
Данные масс-спектрометрии по уровням включения стабильных изотопов 2 Н-и13 Св бензилоксикарбонильные производные аминокислот в пределах одинаковых концентраций тяжёлой воды в среде не отличались от таковых, полученных для метиловых эфиров дансиламинокислот (точность определения уровней изотопного включения в аминокислоты данным методом составляет +5). Данные по уровням включения 2 Н-и 13 С секретируемые аминокислоты исследуемых штаммов приведены в таблице 3. Для введения дейтерия в аминокислоты B. methylicum использовали минимальные среды с 2 об.% СН3 ОН и различным содержанием 2 Н2 О в них, поскольку раннее было показано, что вклад С2 Н3 О2 Н в уровни дейтерированности аминокислот незначителен [10].
13 С-аминокислоты были получены за счёт культивирования штамма M. flagellatum на среде, содержащей обычную воду и 1 об.% к 13 CH3 OH. Во всех анализируемых образцах культуральной жидкости не зависимо от рода штамма присутствовали аланин, валин, лейцин (изолейцин) и фенилаланин (см. табл. 3). В культуральной жидкости M. flagellatum в дополнение вышеназванным аминокислотам также накапливался глицин.
Таблица 3.
Уровни включения 2 Н и 13 С в секретируемые аминокислоты B. methylicum и M. flagellatum (данные получены для Z-,и Dns-производных аминокислот)*.
|
Аминокислоты | Содержание 2 Н2 О в среде, об% 24,5 49,0 73,5 98,0 |
1 % 13 СН3 ОН | |||
| Глицин | - | - | - | - | 60,0 |
| Аланин | 24,0 | 37,5 | 62,5 | 77,5 | 35,0 |
| Валин | 20,0 | 46,3 | 43,8 | 58,8 | 50,0 |
| Лейцин (изолейцин) | 15,0 | 47,0 | 46,0 | 51,0 | 38,0 |
| фенилаланин | 15,0 | 27,5 | 51,3 | 75,0 | 95,0 |