Учебное пособие: Проведение гематологического обследования рыб
3. Приготовление и окраска мазков крови
По окрашенным мазкам крови ведут оценку активности эритропоэза и учет лейкоцитов.
3.1. Оборудование и реактивы:
- обезжиренные предметные стекла,
- шлифованное стекло для изготовления мазка,
- краска Май-Грюнвальда,
- рабочий раствор краски азур-эозина (по Романовскому),
- дистиллированная вода с рН 6,8 - 7,1, нейтрализованная фосфатными буферами.
3.2. Подготовка к исследованию
3.2.1. Подготовка предметных стекол .
- один конец стекла размером в 1-1,5 см шлифуют на наждаке для надписи простым карандашом,
- стекла кипятят в 1 %-ном растворе двууглекислой соды - 10 мин,
- охлаждают и промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой - 5 мин.,
- стекла помещают в слегка подкисленный соляной кислотой раствор дистиллированной воды на 2-3 мин; затем дважды промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в сушильном шкафу и хранят в смеси спирта с эфиром 1:1. Перед употреблением их вынимают, насухо вытирают чистой салфеткой или фильтровальной бумагой. Они готовы к использованию.
3.2.2. Приготовление рабочего раствора краски азур - эозина:
- 5,5 мл концентрированной краски азур - эозина помещают в 250 мл нейтральной дистиллированной воды и тщательно перемешивают.
3.3. Ход работы.
Кровь после взятия (см. п. 2.) наносят в виде небольшой капли на заранее приготовленное обезжиренное предметное стекло, на расстоянии 1,5-2 см от его шлифованного края. Большим и указательным пальцами правой руки берут шлифованное стекло за боковые ребра, ставят на предметное стекло под углом 45° и подвигают тыльной стороной к капле, которая от соприкосновения растекается. Скользящим движением продвигают шлифованное стекло вперед. Кровь должна равномерно распределяться по предметному стеклу в виде мазка. От каждой рыбы готовят не менее двух мазков. После приготовления мазка его высушивают на воздухе в течение 10-15 минут.
Подсохшие мазки без фиксации окрашивают по Паппснгсйму (Романовскому - Гимза). Первый этап - окрашивание и фиксация одновременно раствором Май-Грюнвальда в течение 5 минут, затем промывают нейтральной дистиллированной водой. Второй этап - докрашивание в рабочем растворе Романовского 30-40 минут. Качество окраски клеток контролируют под малым увеличением микроскопа. Окрашенные мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе.
4. Определение содержания гемоглобина
Гемоглобин - это дыхательный пигмент, содержащийся в эритроцитах. Его количество в организме выражается в г/л и имеет важное диагностическое значение. Определять содержание гемоглобина можно двумя способами: по Сали и цианметгемоглобиновым методом. Наиболее распространенным и простым является метод определения гемоглобина по Сали. Однако он дает ряд объективных (постепенное усиление окраски) и субъективных (визуальное сравнение цвета) ошибок. Цианметге-моглобиновьга метод является наиболее точным.
4.1. Метод определения гемоглобина по Сали .
4.1.1. Подготовка к исследованию
Приготовление 0,1 н. раствора соляной кислоты:
- на 1 л дистиллированной воды добавляют химически чистой 8,2 см3 соляной кислоты с удельным весом 1,19, либо 0,1 н. фиксанал соляной кислоты.
4.1.2. Оборудование и реактивы
- гемометр Сали,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- глазная пипетка,
- стеклянная палочка,
- часовое стекло,
- 0,1 н. раствор соляной кислоты,